蜂毒肽可以人工生物合成了 ！

2021-03-25

 

蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表達(dá)


蜂毒肽又稱(chēng)蜂毒溶血肽，是蜂毒的主要活性成分之一，在抗菌、消炎、抗腫瘤乃至肌肉再生等方面具有一定應(yīng)用價(jià)值。目前基因工程技術(shù)為蜂毒肽生產(chǎn)提供了新的途徑，但從研究到生產(chǎn)仍有一定距離。

蜂毒前溶血肽原是prepromelittin基因的表達(dá)產(chǎn)物，在蜜蜂體內(nèi)合成后首先加工成蜂毒溶血肽原（蜂毒肽前體蛋白，promelittin），這是蜂毒肽的前體形式，可被進(jìn)一步水解而形成蜂毒肽。蜂毒前溶血肽原由70個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)主要包括信號(hào)肽（1～21 aa，aa為氨基酸個(gè)數(shù)的縮寫(xiě)）、低復(fù)雜性區(qū)域（22～43 aa）和蜂毒肽結(jié)構(gòu)域（44～69 aa）。與蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對(duì)細(xì)胞的破壞能力小，可以考慮作為利用基因工程方法在體外合成蜂毒肽的初始產(chǎn)物。

為進(jìn)一步探討利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽的方法，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等對(duì)蜂毒前溶血肽原基因序列進(jìn)行改造，并利用人工化學(xué)合成方法完成改造后全基因的合成。

構(gòu)建蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞后分別在20、37 ℃條件下經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，并利用SDS-PAGE和Western Blot對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果表明，表達(dá)體系成功表達(dá)了目的融合蛋白，在20 ℃條件下可獲得可溶性表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步分離純化目的蛋白及獲得蜂毒肽提供了基礎(chǔ)。

 

討論與結(jié)論

利用人工化學(xué)合成技術(shù)獲得全基因序列為基因的改造提供了方便。這種方法既可以縮短合成周期，又為序列的正確性提供了保障。同時(shí)，在進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，可以有效地根據(jù)原核生物密碼子偏好性及其他需要對(duì)目的片段的基因序列進(jìn)行優(yōu)化及定點(diǎn)突變，密碼子的優(yōu)化將有利于目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)高效精確地表達(dá)。

蜂毒前溶血肽原基因CDS序列全長(zhǎng)僅213 bp，可以按一定原則對(duì)其進(jìn)行充分改造，再利用上述方法將其合成，使之滿(mǎn)足在不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的需要。

對(duì)基因序列進(jìn)行改造過(guò)程中考慮到應(yīng)用羥胺裂解方法對(duì)GST-蜂毒前溶血肽原融合蛋白進(jìn)行處理以獲得蜂毒肽，所以在原序列上添加了相應(yīng)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子（AAC），使表達(dá)產(chǎn)物中蜂毒肽結(jié)構(gòu)域前形成羥胺裂解位點(diǎn)（Asn-Gly）。

若考慮通過(guò)其他酶或化學(xué)物質(zhì)從表達(dá)產(chǎn)物上將蜂毒肽切割下來(lái)，可以設(shè)計(jì)其他相應(yīng)密碼子，如利用腸激酶作用位點(diǎn)時(shí)，可在蜂毒前溶血肽原基因中蜂毒肽對(duì)應(yīng)的序列首密碼子前添加GAC GAC GAC GAC AAG序列。

已知多種酶或化學(xué)試劑在蜂毒前溶血肽原上沒(méi)有切割位點(diǎn)或在蜂毒肽結(jié)構(gòu)域沒(méi)有切割位點(diǎn)，可以按照此思路在蜂毒肽前溶血肽原基因中相應(yīng)位置添加對(duì)應(yīng)的密碼子序列。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽被看作是獲得蜂毒肽的新途徑，研究者關(guān)注蜂毒肽對(duì)細(xì)胞的毒性，探索利用融合蛋白等方式實(shí)現(xiàn)蜂毒肽在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞中的表達(dá)。

考慮到蜂毒肽在蜜蜂體內(nèi)以其前體蛋白蜂毒前溶血肽原的形式表達(dá)，筆者設(shè)計(jì)了蜂毒前溶血蛋白原的全基因序列，期望以此降低其對(duì)細(xì)胞的破壞作用。為了便于從表達(dá)產(chǎn)物中分離目的蛋白，選擇了利用GST融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。

構(gòu)建的蜂毒前溶血肽原與GST融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel能夠在不同溫度下進(jìn)行表達(dá)，其在20 ℃條件下表達(dá)的目的蛋白一部分以可溶性蛋白的形式存在，為進(jìn)一步分離純化表達(dá)產(chǎn)物并進(jìn)行切割以獲得有活性的目的蛋白提供的方便。

但由于GST標(biāo)簽自身相對(duì)分子質(zhì)量較大，而設(shè)計(jì)的目的蛋白又非常小，對(duì)相關(guān)下游試驗(yàn)可能會(huì)有較大影響。考慮到設(shè)計(jì)的目的蛋白蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，對(duì)細(xì)胞膜的破壞能力較低，也可以嘗試使用分子量較小的His標(biāo)簽。

蜂毒前溶血肽原本身具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，若有好的無(wú)標(biāo)簽分離純化目的蛋白的方法，也可以嘗試直接表達(dá)蜂毒前溶血肽原。而有關(guān)其表達(dá)量的提高及表達(dá)產(chǎn)物的處理等仍需進(jìn)一步研究。

（來(lái)源：江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)   ISSN號(hào)：1002-1302   2020年16期）